在這篇小綜述中，我們描述了多微生物導(dǎo)致膿毒癥的分子機(jī)制，即一系列不良反應(yīng)包括炎癥和血栓前途徑的激活、免疫系統(tǒng)缺陷和多器官功能障礙。補(bǔ)體激活是膿毒癥的一個(gè)公認(rèn)特征，尤其是C5a和C5b-9的產(chǎn)生，以及C5a相關(guān)受體的參與。C5a激活中性粒細(xì)胞導(dǎo)致DNA被擠出，形成含有髓過氧化物酶、氧化酶、以及細(xì)胞外組蛋白的中性粒細(xì)胞胞外誘捕器。產(chǎn)生下游補(bǔ)體激活產(chǎn)物，C5b-9(稱為膜攻擊復(fù)合物MAC)也在膿毒癥中產(chǎn)生。C5b-9激活NLRP3炎癥小體，損傷線粒體，同時(shí)在血漿中出現(xiàn)IL-1和IL-18。組蛋白具有強(qiáng)烈的促發(fā)炎和促血栓形成作用，導(dǎo)致血小板聚集與靜脈血栓形成。多器官功能障礙也是膿毒癥的一個(gè)特征。眾所周知，膿毒性心肌病，如果嚴(yán)重，可以導(dǎo)致死亡。膿毒癥的這種并發(fā)癥與三種關(guān)鍵蛋白(SERCA2，NCX，Na+/K+-ATP酶)有關(guān)。這三種關(guān)鍵蛋白的減少是補(bǔ)體和組蛋白依賴性的。這些ATP酶的功能障礙與膿毒癥的心肌病有關(guān)。這些數(shù)據(jù)可能提示人類膿毒癥的理想的新靶點(diǎn)。

補(bǔ)體受體，補(bǔ)體，組蛋白，NLRP3炎癥小體

在北美感染性的膿毒癥每年發(fā)病50多萬人，死亡率為～40%，具體取決于膿毒癥的嚴(yán)重程度。這些感染主要是由細(xì)菌引起的，但病毒、真菌和原生動(dòng)物也可能引起膿毒癥。盡管對(duì)動(dòng)物和人類的膿毒癥進(jìn)行了廣泛研究，尚沒有一種聯(lián)邦藥品管理局(FDA)特別批準(zhǔn)的藥物專門治療膿毒癥。支持性治療如液體復(fù)蘇、廣譜抗生素的早期應(yīng)用和機(jī)械通氣的安全技術(shù)已經(jīng)改善了膿毒癥患者的臨床療效。這個(gè)小綜述描述了從小鼠多菌性膿毒癥的研究獲得的新見解或許可以給未來人類膿毒癥研究鋪平道路。

在人類和小鼠身上重要的基因組研究影響了我們對(duì)膿毒癥的理解。幾年前，一個(gè)研究小組利用了經(jīng)過實(shí)驗(yàn)性膿毒癥、燒傷等“炎性應(yīng)激”的人類和小鼠的白細(xì)胞，進(jìn)行研究了比較基因組學(xué)分析，Seok等人的報(bào)告得出結(jié)論：“小鼠的基因組反應(yīng)模型很難模擬人類的炎癥性疾病”。這導(dǎo)致很多報(bào)紙上的報(bào)道，暗示用小鼠與了解人類膿毒癥相關(guān)性不大。2015年，日本的一個(gè)團(tuán)隊(duì)使用同樣的數(shù)據(jù)庫得出了相反的結(jié)論“小鼠模型中的基因組反應(yīng)非常類似于人類炎癥疾病”。截止到2018年，這一爭議尚未解決，這代表了這一領(lǐng)域被困擾的問題，尤其是因?yàn)檫@兩篇文章都發(fā)表在受人尊敬的科學(xué)雜志上(美國國家科學(xué)院院刊)。到現(xiàn)在為止對(duì)膿毒癥小鼠的基因組分析能否可靠地推導(dǎo)到有膿毒癥患者上沒有共識(shí)，這導(dǎo)致了各大公司都避免在膿毒癥領(lǐng)域進(jìn)行研究投資，不管這些項(xiàng)目涉及多菌膿毒癥的小鼠或人類的膿毒癥。另一方面，應(yīng)強(qiáng)調(diào)使用膿毒癥小鼠已經(jīng)允許在人類膿毒癥中做不到的研究(例如測量心肌細(xì)胞中的調(diào)節(jié)蛋白，CMs)。膿毒癥小鼠在信號(hào)傳導(dǎo)方面路徑方面以及如何操縱這些路徑以減少膿毒癥的器官功能障礙方面提供了重要信息(至少在小鼠身上)。最后，研究表明C5a補(bǔ)體產(chǎn)物與膿毒癥小鼠和人類的膿毒癥不良反應(yīng)有關(guān)。小鼠基因敲除(KO)(缺乏C5a受體;C5aRs)已被證明可以預(yù)防在膿毒癥的心肌病發(fā)展。這強(qiáng)調(diào)了在膿毒癥小鼠中可以進(jìn)行某些操作，提供重要信息關(guān)于膿毒癥如何引起器官功能障礙這些資料可應(yīng)用于感染的人類。

是多微生物性膿毒癥常被用于大鼠和小鼠的膿毒癥研究中，尤其是盲腸結(jié)扎和穿孔(CLP)引起的膿毒癥，通常出現(xiàn)人類的臨床表現(xiàn)非常相似膿毒癥。該技術(shù)最初近40年以前被報(bào)道，目前已經(jīng)被廣泛使用，部分原因也是KO小鼠的存在。這項(xiàng)技術(shù)包括多次盲腸穿刺，把少量糞便擠出到腹腔。這個(gè)膿毒癥的嚴(yán)重程度可由穿刺次數(shù)和針的大小(規(guī)格)決定。“多微生物”指存在膿毒癥小鼠的腹腔和血液中出現(xiàn)需氧和厭氧細(xì)菌。多微生物膿毒癥模型很少用于大型動(dòng)物或類人靈長類動(dòng)物是因?yàn)椋涸谶@種情況下，必須有一個(gè)重癥監(jiān)護(hù)室，需要24小時(shí)的動(dòng)物護(hù)理，所有這些都會(huì)導(dǎo)致異常高昂的手術(shù)費(fèi)用。此外，獲得機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)因?yàn)樵诜侨遂`長類動(dòng)物身上使用CLP會(huì)有很大的問題。

補(bǔ)體激活產(chǎn)物及相關(guān)受體參與多微生物膿毒癥如圖1所示。膿毒癥的發(fā)生觸發(fā)激活了幾種補(bǔ)體途徑，其中“經(jīng)典”和“替代”途徑在多微生物膿毒癥中被激活。究竟是什么觸發(fā)了這些途徑的激活尚待確定。經(jīng)典途徑中的C5轉(zhuǎn)化酶涉及C4b和C2a，而在替代路徑C3b和Bb中代替了C5轉(zhuǎn)化酶。無論哪種情況，都會(huì)生成C5a和C5b。目前尚不清楚是什么觸發(fā)了傳染性疾病的補(bǔ)體激活多微生物性膿毒癥小鼠或人的膿毒癥血癥。目前公認(rèn)的是革蘭氏陰性菌通常通過凝集素途徑相互作用激活補(bǔ)體。其特征是甘露糖凝集素在細(xì)菌表面與碳水化合物結(jié)合。與先天免疫系統(tǒng)有關(guān)，有很多模式相關(guān)的模式分子和損傷相關(guān)的模式分子，可以激活補(bǔ)體。例如，細(xì)菌革蘭陰性菌LPS是一種著名的細(xì)菌產(chǎn)物可以激活補(bǔ)體替代途徑。脂多糖與TLR2和TLR4相互作用可激活多種細(xì)胞(圖2)。最后，某些革蘭氏陽性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌)可以分泌阻止補(bǔ)體分子激活的蛋白質(zhì)。第三途徑(“凝集素”途徑)有時(shí)是細(xì)菌引起的補(bǔ)體激活的主要途徑。無論什么途徑被觸發(fā)，都有C5a的出現(xiàn)，這種強(qiáng)大的過敏毒素與它的受體(C5AR1和C5AR2)發(fā)生反應(yīng)。尤其在中性粒細(xì)胞(PMN)中普遍存在。結(jié)果

圖1感染性膿毒癥發(fā)生的事件順序：補(bǔ)體激活的重要作用產(chǎn)生兩大產(chǎn)物，C5a和C5b-9(膜攻擊)的產(chǎn)生復(fù)雜)。C5a激活多形核白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)形成網(wǎng)，釋放細(xì)胞外組蛋白和促炎肽類。C5b-9激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致兩種有效細(xì)胞因子IL-1和IL-18的釋放。

有很多PMN強(qiáng)烈被激活，其次還有一些巨噬細(xì)胞被一定程度激活。激活的PMN釋放長鏈DNA，形成中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)，同時(shí)釋放組蛋白以及PMN特異性顆粒(髓過氧化物酶、蛋白酶等)的產(chǎn)物。組蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4)是促炎和促血栓形成活性的有效生物反應(yīng)誘導(dǎo)分子。如圖2所示，細(xì)胞外組蛋白在人和小鼠膿毒癥癥中起關(guān)鍵作用效應(yīng)器的作用。組蛋白可引起彌漫性血管和上皮細(xì)胞損傷，在膿毒癥多器官功能障礙中起重要作用。下游補(bǔ)體激活也導(dǎo)致C5b-9(膜攻擊復(fù)合物;MAC)的產(chǎn)生(圖3)。

圖2感染性膿毒癥導(dǎo)致與TLR2和TLR4相互作用的細(xì)胞外組蛋白的出現(xiàn)。這導(dǎo)致血栓形成時(shí)凝血系統(tǒng)的激活，激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞觸發(fā)一系列促炎癥反應(yīng)結(jié)果，以及隨之而來的細(xì)胞損傷和凋亡。

經(jīng)典途徑或替代途徑產(chǎn)生C5轉(zhuǎn)化酶，產(chǎn)生C5a和C5b。C5a與C5aR在PMN中相互作用，導(dǎo)致產(chǎn)生NETs，釋放組蛋白強(qiáng)大的促炎功能。C5b的生成與C6、C7、C8和C9形成C5b-9。我們知道這個(gè)復(fù)合體會(huì)激活NLRP3炎癥小體導(dǎo)致炎癥小體激活，線粒體損傷和IL-1和IL-18這些強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子的釋放。它的NLRP3炎癥小體前驅(qū)體模式存在于多種細(xì)胞(PMNs、巨噬細(xì)胞)中，心肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等)。

簡而言之，炎癥小體程序包括：“啟動(dòng)”階段，細(xì)胞暴露于脂多糖(100 ng/mL)的在37°C下持續(xù)4小時(shí)。這導(dǎo)致少量IL-1β釋放。此后，細(xì)胞暴露在1mmol/L的ATP中45分鐘，ATP作為一種“激活劑”，導(dǎo)致大量釋放IL-1β。Suresh等人。同時(shí)也證明了補(bǔ)體介導(dǎo)的“旁觀者”損傷，在巨噬細(xì)胞吞噬補(bǔ)體調(diào)理顆粒過程中，引發(fā)NLRP3炎癥小體活化，導(dǎo)致caspase-1活化并IL-1β、IL-18分泌，補(bǔ)體依賴性激活或炎性激活可通過上述機(jī)制引起急性細(xì)胞和器官損傷(通過C5a和C5b-9引起的功能障礙)。當(dāng)補(bǔ)體或炎癥激活發(fā)生時(shí)，就可能發(fā)生這種不良事件。從這個(gè)意義上講，細(xì)胞損傷不會(huì)的發(fā)生是一種非靶向性的方式，在炎癥發(fā)生在補(bǔ)體或炎性小體激活的附近，使多種細(xì)胞受到破壞。

關(guān)于細(xì)菌和補(bǔ)體系統(tǒng)，革蘭氏陽性細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌，目前比較確定的是革蘭氏陽性菌耐受補(bǔ)體激活效應(yīng)。而革蘭陰性菌對(duì)補(bǔ)體激活活化的影響敏感。例如，金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥，可能會(huì)造成對(duì)病人嚴(yán)重的危險(xiǎn)。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，許多格蘭陰性菌釋放與TLRs(2、3、4和9)反應(yīng)的LPS，在膿毒癥的條件下可能共同導(dǎo)致感染性膿毒血癥的事件。補(bǔ)體激活產(chǎn)物，如C3b和iC3b通過PMNs和巨噬細(xì)胞促進(jìn)細(xì)菌吞噬和胞內(nèi)殺傷，通常借助NADPH氧化酶及其產(chǎn)物、氧自由基。另外，如前所述，MAC對(duì)細(xì)菌還有溶細(xì)胞活性，一般通過MAC或凝集素和NLRP3炎癥途徑。細(xì)菌同樣也能激活凝集素補(bǔ)體途徑，產(chǎn)生如上所述的抗菌作用。還應(yīng)注意的是，某些革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌)釋放的肽類能阻斷補(bǔ)體活化或補(bǔ)體活化產(chǎn)物的激活。

補(bǔ)體復(fù)合物如C5b-7或C5b-8有無細(xì)胞損傷活性在實(shí)驗(yàn)研究中基本上沒有令人信服的依據(jù)。摩根最近的一項(xiàng)研究研究組發(fā)現(xiàn)，在沒有C9的情況下，通過研究細(xì)胞因子產(chǎn)生、炎性小體激活、細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子增加、線粒體功能障礙和細(xì)胞色素c釋放情況發(fā)現(xiàn)：MAC亞體不能導(dǎo)致人肺部炎癥和導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡。應(yīng)該提到的是大多數(shù)與C5b-7和C5b-8相關(guān)的報(bào)道均未提示其對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有損傷作用。

膿毒癥的細(xì)胞損傷圖2描述了我們最近的工作，它定義了CLP誘導(dǎo)的膿毒癥發(fā)病后心臟中發(fā)生的信號(hào)通路激活。主要的事件是C5a激活PMNs，導(dǎo)致NETs以及細(xì)胞外組蛋白出現(xiàn)。已經(jīng)證實(shí)組蛋白與包括CMs的各種細(xì)胞類型的TLR結(jié)合。這導(dǎo)致血小板活化與血栓形成。另一個(gè)主要事件是在細(xì)胞外組蛋白存在激活PMN和巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致各種細(xì)胞中產(chǎn)生氧化劑(活性氧ROS)，同樣也產(chǎn)生各種促炎肽(細(xì)胞因子、趨化因子、以及其他因素)，所有這些都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，而且，通常導(dǎo)致凋亡。尤其是在感染性膿毒癥的環(huán)境中。組蛋白的其他損傷特征是它們可以直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡，并且具有促血栓和促炎癥作用。很多研究表明，組蛋白與不同的TLR結(jié)合(主要是TLR2和TLR4)并與不同細(xì)胞類型上的受體相互作用，這取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)置和使用的細(xì)胞系不同，有關(guān)于組蛋白激活TLR2或TLR4的額外數(shù)據(jù)。Xu等人的研究顯示TLR4，但不是TLR2，是組蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞因子炎癥的主要受體，根據(jù)TLR4 KO小鼠輸注組蛋白后的反應(yīng)研究。Ekaney等人還表明，阻斷TLR4導(dǎo)致人內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性(根據(jù)乳酸脫氫酶測定和碘化丙啶染色)。它已經(jīng)證明，TLR2和TLR4阻斷性抗體阻斷抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗血管生成作用。我們還發(fā)現(xiàn)了來自雙TLR2和TLR4 KO小鼠的巨噬細(xì)胞比單獨(dú)TLR2或TLR4KO小鼠的巨噬細(xì)胞能顯著減少暴露于組蛋白后炎癥引起的IL-1β釋放。

在聚微生物膿毒癥是圖3描述了感染性膿毒癥如何激活一系列對(duì)小鼠心臟功能不利影響的信號(hào)通路。最初，MAPK，特別是p38和Akt信號(hào)通路激活，隨后血漿中各種細(xì)胞因子，趨化因子和細(xì)胞外組蛋白水平升高。這些事件的結(jié)果引起心肌細(xì)胞的嚴(yán)重功能障礙。心肌功能不全的基礎(chǔ)與p38激活有關(guān)，因?yàn)樗苄詐38抑制劑阻斷膿毒癥引起的心功能不全(如由超聲多普勒參數(shù)確定)的發(fā)生。膿毒癥心肌病的原因可追溯到Na+K+ATP酶的功能不全，這一點(diǎn)至關(guān)重要對(duì)于心肌細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的有效動(dòng)作電位。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶 2型(SERCA2)和Na+/Ca2+(NCX)交換泵導(dǎo)致心肌舒張期[Ca2+]i積聚(以一種與心肌舒張期胞漿[Ca2+]i清除障礙相關(guān)的方式)。這些事件導(dǎo)致心肌細(xì)胞的實(shí)質(zhì)性功能障礙和凋亡。我們相信這些事件可能同樣發(fā)生在其他器官(腦、肝、肺等)，導(dǎo)致膿毒癥多器官功能障礙。根據(jù)這些信息，阻斷p38的激活可能是一種預(yù)防膿毒癥性心功能不全發(fā)生的策略。

圖3感染性膿毒癥引起膿毒癥心肌病的事件，定義為心肌細(xì)胞收縮和舒張缺陷。結(jié)果可以追溯到心肌細(xì)胞中MAPK(p38)和Akt激活，導(dǎo)致心功能不全。這些缺陷與動(dòng)作電位缺陷(Na+/K+-ATP酶降低)，以及[Ca2+]i調(diào)節(jié)蛋白、SERCA2和Na+/Ca2+交換酶活性的降低有關(guān)。

圖中的數(shù)據(jù)。1-3強(qiáng)調(diào)膿毒癥出現(xiàn)時(shí)補(bǔ)體的激活產(chǎn)物和組蛋白最終導(dǎo)致心臟功能障礙。因?yàn)镃5a是誘發(fā)在感染性心肌病中發(fā)展的很多缺陷的關(guān)鍵因素，體內(nèi)阻斷C5a或者C5aRs對(duì)膿毒癥小鼠有明顯的潛在治療作用。

這種抑制劑目前還沒有，仍在研制中。在人類的嚴(yán)重膿毒癥中，大多數(shù)致命性事件發(fā)生在敗血癥發(fā)病后的最初3-5天，尤其是老年膿毒癥患者。C5a或信號(hào)途徑抑制劑只在有限的時(shí)間內(nèi)(3-5天)。目前，有幾家制藥公司正在開發(fā)能阻斷C5a或C5的小分子化合物，盡管尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)以評(píng)估這些化合物安全性和的功效。就C5b-9阻斷藥而言除了C5抗體(結(jié)果是阻斷C5b-9的產(chǎn)生)，似乎還沒有任何FDA批準(zhǔn)的藥物。但是，使用人C5(依庫麗珠單抗eculizumab)單克隆抗體阻止C5a和C5b-9產(chǎn)生，也與腦膜炎球菌性腦膜炎的發(fā)生傾向有關(guān)。有一些影響補(bǔ)體系統(tǒng)的疾病，如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿以及非典型溶血性尿毒癥綜合征，臨床試驗(yàn)表明eculizumab是有效和安全的。然而，在感染性膿毒癥中如果合并菌血癥，使用抗C5很可能面臨FDA批準(zhǔn)的門檻很高，此類干預(yù)的安全性臨床試驗(yàn)需要花費(fèi)很高。從短期來看似乎不太可能獲得FDA的批準(zhǔn)。發(fā)展小分子抑制劑比阻斷C9的活化表位是阻斷C5b-9生物活性的一個(gè)有吸引力的策略。

目前有一些單抗可以阻斷活化的C9的表位，但是這種單克隆抗體還沒有用于人類。在感染性人類中使用復(fù)合IL-1受體激動(dòng)劑(IL-1ra)靶向的IL-1(NLRP3炎癥激活產(chǎn)生)的嘗試已經(jīng)失敗，聯(lián)合靶向IL-1、IL-18的藥物治療膿毒癥小鼠的研究顯示了有希望的數(shù)據(jù)。Vanden Berghe等人，使用CLP或LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥研究表明IL-1r拮抗劑和抗IL-18的中和作用對(duì)小鼠的內(nèi)毒素致死性起到保護(hù)作用。他們也在應(yīng)用IL-1和IL-18基因缺陷小鼠研究發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。盡管需要臨床研究來確認(rèn)小鼠的聯(lián)合治療數(shù)據(jù)，IL-1阻斷的臨床實(shí)驗(yàn)的失敗阻止了加做阻斷IL-1ra為特征的臨床試驗(yàn)。有趣的是，除膿毒癥外，阻斷C5a或其受體或C5b-9可能還有與人類的許多其他疾病相關(guān)，如急性心臟病缺血、急性肺損傷、自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和早期移植排斥反應(yīng)。